牙髓干細胞的生物學特性及應用

　　摘    要：　牙髓干細胞是源自于牙髓組織的一種成體干細胞，具有多向分化、高度增殖潛能，免疫調節能力和旁分泌作用，已成功用于牙齒、骨、神經、肌肉、角膜等組織重建及再生，呈現出良好的臨床應用前景。現就牙髓干細胞的生物學特性、組織工程及再生醫學中的應用、存在的問題及未來的研究方向作簡要綜述。

　　關鍵詞：　牙髓干細胞; 組織工程; 再生醫學;

　　Abstract：　Dental pulp stem cells are a kind of adult stem cells derived from dental pulp characterized by multidifferentiation capability, high proliferation rate, immunoregulatory property and paracrine capability, which endows them with great therapeutic potential for repairing damaged or defective tissues. They have been successfully used in the reconstruction and regeneration of teeth, bone, nerve muscle and cornea, which holds great promise for clinical application. This review described the biological characteristics of dental stem cells, the application of the tissue engineering and regenerative medicine, the existing problems and future research direction.

　　Keyword：　dental pulp stem cell; tissue engineering; regenerative medicine;

　　理想的種子細胞是組織工程領域研究的重點，必須具有來源豐富、易于分離培養、體外培養及重建過程具有較強的增殖能力并長期維持生理功能及生物活性、能控制分化方向及應用安全等特點。2000年，Gronthos等[1]利用消化酶法將人類健康第3磨牙牙髓制備成單細胞懸液，經過培養得到能夠形成細胞克隆和具有高度增殖能力的細胞，并將其命名為牙髓干細胞（dental pulp stem cells,DPSCs）。DPSCs取自牙髓組織，具有良好的生物學特性，如高度增殖、自我更新能力和多向分化潛能，自體移植能最大限度降低免疫排斥反應和交叉感染風險，來源豐富，取材簡便，不對人體造成二次傷害且不涉及倫理問題。近年來，DPSC在組織工程及再生醫學方面的應用日益受到研究者關注，現對其研究進展進行綜述。
 

　　1 、DPSCs的生物學特性

　　1.1 、多向分化、高度增殖潛能

　　DPSCs來源于胚胎時期神經嵴的骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenehymal stem cells,BMMSCs)[2,3]，表達間充質干細胞（mesenchymal stem cell,MSC）的表面標記SH2、SH3、SH4和胚胎干細胞（embryonic stem cell,ESC）的表面標記OCT 4、NANOG、SSEA-3和SSEA-4。體外培養具有向三胚層（內、中、外）細胞分化的能力[4,5]。研究顯示，體外培養的DPSCs呈梭形，在適當的誘導條件下可分化成為破骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞、毛囊細胞、角膜上皮細胞、神經細胞和黑色素細胞等[6]。雖然DPSCs和BMMSCs均可向骨、軟骨、肌肉、脂肪和神經方向分化，然而DPSCs卻表現出更高的分化能力，其增殖速度是BMMSCs的30～50倍[7,8]，提示DPSCs將為組織修復再生醫學的發展提供新的發展方向。

　　1.2、 免疫調節能力

　　DPSCs和BMMSCs均具有強大的免疫調節能力。研究表明[9],DPSCs具有誘導活化T細胞凋亡、減輕免疫相關組織損傷的能力。FasL(Fas ligand,FasL）是一種跨膜蛋白，在Fas凋亡通路中發揮重要作用。利用siRNA技術敲除DPSCs中FasL能降低其誘導T細胞凋亡的能力，并能降低其抗炎療效，說明DPSCs免疫調節能力由FasL調控。然而，FasL表達水平并不影響DPSCs的增殖速率和多向分化能力。動物實驗表明[10]DPSCs具有顯著抑制輔助性Th17細胞（T helper 17,Th17）的作用，移植DPSCs后能夠逆轉系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus,SLE）相關功能障礙。Ding等[11]研究顯示，DPSCs通過分泌轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1）抑制淋巴細胞增殖。將DPSCs移植到缺血缺氧小鼠模型中，能產生抗炎反應并促進組織修復[12]。He等[13]報道脂多糖能夠刺激DPSCs高表達白細胞介素-8(interleukin-8,IL-8),IL-8是趨化因子家族的細胞因子，對中性粒細胞有趨化能力，在調節炎癥反應中發揮重要作用，如果DPSCs誘導分化后仍然具有與未分化時相似的免疫調節能力，可以通過調節免疫特性成為治療免疫疾病的干細胞資源。

　　1.3 、旁分泌作用

　　體內實驗顯示，DPSC能通過旁分泌形式分泌-系列細胞因子[14,15,16,17,18,19,20]，如基質細胞衍生因子-1(chemokine stromal cell-derived factor-1,SDF-1）、腦源性神經生長因子（brainderived neurotrophic factor,BDNF）、睫狀神經生長因子（ciliary neurotrophic factor,CNTF）、膠質細胞衍生的神經營養因子（glial cell-derived neurotrophic factor,GDNF）、神經生長因子（nerve growth factor,NGF）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、粒細胞集落刺激因子（granulocyte-colony stimulation factor,G-CSF）和干細胞因子（stem cell factor,SCF），這些細胞因子具有促進新生血管生成、抗凋亡及保護再生組織的作用。Song等[21]研究顯示，DPSCs在缺血性動物模型中對星形膠質細胞表現出優越的細胞保護作用。將DPSCs植入局灶腦缺血后24 h內嚙齒類動物模型的大腦中，4周時可見動物神經學行為得到極大改善，而且對側前肢的感覺運動功能明顯提高，雖然此時植入的DPSCs僅有約2.3%的存活率，但是這些細胞能定向遷移到大腦缺血區域，并分化為星形膠質細胞或神經細胞，研究者提出這種功能的改善不是神經的替換而更多的是依賴于DPSCs的旁分泌作用[22]。DPSCs還能誘導小鼠動物模型后肢局部缺血處功能性新生血管形成[23]。

　　2、 DPSCs在組織工程及再生醫學研究中的應用

　　2.1 、在牙修復重建中的應用

　　齲齒和牙髓炎嚴重影響患者的生活質量，目前主要采用根管治療，即清除髓腔內的牙髓組織并應用合成材料填充髓腔，治療后的牙齒脆弱、易于骨折并有再次感染可能。Asghari等[24]將DPSCs放在含有地塞米松（dexamethasone,DXM）、抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉以及骨形成蛋白-7(bone morphogenetic protein 7,BMP-7）的培養基中誘導培養，顯示新生的成牙本質樣細胞以及大量的鈣結節和膠原沉積形成，并表達堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨鈣蛋白（osteocalcin,OCN）、牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphopmtein,DSPP）、牙本質基質蛋白-1(dentin matrix protein,DMP-1）等成分。周慧等[25]提出，轉化生長因子β3與肝素聯合作用可誘導人類乳牙牙髓干細胞（human immature dental pulp stem cells,HIDPSCs）分化為成牙本質細胞、ALP活性增強、DSPP表達增加。Tran等[26]將DPSCs與人類牙本質共培養并移植到小鼠模型中，顯示牙本質樣組織形成。張紅梅等[27]研究表明，小腸黏膜下層浸提液能明顯刺激體外培養的DPSCs增殖，誘導細胞礦化并能提高細胞ALP水平，誘導后的DPSCs表達DSPP和DMP-1。DPSCs在體外構建組織工程牙將逐漸成為可能，這對于提高缺牙患者的生活質量具有遠大意義。

　　2.2 、在骨修復重建中的應用

　　骨基質具有獨特的礦化能力，尋找理想的種子細胞是骨組織工程研究的熱點。由于成骨細胞起源于BMMSCs，而DPSCs又是BMMSCs的一種，因此Kermani等[28]將DPSCs在含有抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、MEM的成骨誘導培養基中誘導培養后，顯示DPSCs可以向成骨細胞分化，并表達成骨標志物：ALP、骨橋蛋白（osteopontin,OPN）和OCN，另外DPSCs還具有骨特有的礦化能力[29]，能形成鈣鹽沉積和礦化結節，是骨再生修復中成骨細胞的潛在干細胞來源。文軍等[30]研究顯示，改良富血小板血漿對HIDPSCs的增殖和成骨分化具有一定的促進作用，且體積分數為2%的改良富血小板血漿促增殖能力最強，堿性磷酸酶活性達到最高。這就表明適宜質量分數的富血小板血漿可以顯著促進DPSCs的成骨分化能力。Chamieh等[31]將DPSCs與蠶絲蛋白支架共同培養，DPSCs表現出較高的礦化能力，能夠分化為骨組織，并能表達OCN和膠原蛋白。Wolosz等[32]通過DPSCs與膠原蛋白凝膠支架結合促進大鼠顱面骨的愈合，顯示再生骨骨密度、纖維結締組織以及礦化骨組織的體積明顯增加。早在2009年，DPSCs在骨組織缺損修復領域已進入臨床研究階段[33]，但其具體的調控機制仍然存在很多問題，有待進一步探索研究。

　　2.3 、在神經修復重建中的應用

　　脊髓損傷后，神經元、神經膠質細胞損傷，殘余的軸突難以再生從而導致持續性神經功能障礙。DPSCs是神經嵴來源的干細胞，具有分化為神經細胞的潛能，其研究為神經系統疾病的治療開辟了新思路。方成志等[34]應用含氫化可的松、二甲基亞砜、丁羥基茴香醚、forskolin、β-巰基乙醇的條件培養基誘導DPSCs，能分化為神經元樣細胞和神經膠質細胞，并能表達神經細胞特異型標志巢蛋白和膠質纖維酸性蛋白。研究表明，移植HIDPSCs對脊髓損傷具有顯著的治療效果，其促進神經再生的主要機制為：（1）抑制早期炎癥反應；（2）抑制脊髓損傷導致的神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞的凋亡，保護神經纖維和髓鞘；（3）通過旁分泌的形式直接抑制軸突生長抑制因子（髓鞘相關糖蛋白、硫酸軟骨素蛋白多糖）的釋放；（4）在脊髓損傷部位，DPSCs分化為成熟的神經元和少突膠質細胞，促進軸突的生長，這表明HDPSCs在神經損傷再生治療中的應用潛力，有望成為修復脊髓損傷一種安全有效又可靠的臨床治療手段[35,36]。最近研究[37]報道含混合生長因子音猬因子（sonic hedgehog,SHH）、纖維母細胞生長因子8(fibroblast growth factor 8,FGF-8）、GDNF和毛喉素（forskolin）的培養基能誘導人SHEDs分化成包含DA能神經元的細胞群。

　　2.4 、在肌肉修復重建中的應用

　　杜氏肌肉營養不良癥（DMD）是由于缺乏功能性結構蛋白肌，導致嚴重的肌肉萎縮癥、行動不便，患者通常在20歲左右時就會因為心肌、肺肌無力而死亡。Chen等[38]研究顯示，抑制miR-143的表達能顯著增強肌分化因子和快肌凝蛋白重鏈基因的表達，并提出miRNA參與調節脊椎動物不同肌肉類型功能的表達。Li等[39]用5-氮雜-2'-脫氧胞苷處理DPSCs,miR-135和miR-143表達明顯受到抑制，DPSCs表現出顯著的成肌特性并有肌小管形成，由此得出miRNAs在誘導DPSCs肌源性分化的過程中起到決定性作用。另有研究者[40]報道，DPSCs能夠從減小纖維化和促進血管生成兩個方面來改善DMD小鼠模型營養不良骨骼肌組織的病理狀態，這些結果為進一步研究將DPSCs更有效用于肌肉修復再生的機制鋪平了道路。

　　肌肉萎縮癥是X連鎖隱形遺傳病，平均每3 500個男性新生兒中就有1個肌肉萎縮癥患兒。曾有研究者[41]提出DPSCs可表達特異性的成肌細胞表面標志物α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin），在適當的培養條件下可開啟成肌特異性基因并分化為肌源性細胞，將DPSCs與鼠肌C2C12細胞在嗜酸乳桿菌培養基中共同培養可觀察到肌管融合現象[42]。此后有研究者將DPSCs注射到患肌肉萎縮癥的金毛獵犬體內，免疫熒光檢測顯示肌纖維形成，肌萎縮癥狀明顯改善[43]。急性心肌梗死裸鼠心肌注射DPSCs 4周，梗死區大量新生血管生成、梗死面積明顯減小，左心室功能顯著提高[44]，提示DPSCs是治療肌肉萎縮和急性心肌梗死潛在的干細胞來源。

　　2.5 、在角膜修復重建中的應用

　　角膜盲是嚴重的致盲性眼病，目前主要治療方法是同種異體角膜移植，供體來源匱乏及免疫排斥反應等限制了其臨床應用。組織工程角膜構建是目前眼科界研究的熱點，理想的種子細胞是其中的關鍵要素。Monteiro等[45]報道DPSCs體外可持續表達角膜緣干細胞（1imbal stem cell,LSC）特異性標記物，隨后該團隊又將組織工程人未成熟DPSCs植片直接放置在堿燒傷兔角膜暴露的透明角膜基質上，1～12周實驗動物角膜透明度逐漸改善，組織學分析顯示角膜燒傷處有形態良好的基質層結構和復層上皮形成，證明接種人未成熟DPSCs能夠促進堿燒傷動物角膜形成功能性的角膜上皮組織[46]。Kushnerev等[47]以角膜接觸鏡為載體成功地將DPSCs移植到角膜表面，并檢測到角膜上皮標記物CK3、CK12等的表達，再次證實了DPSCs向角膜上皮細胞分化的潛能。并且相關研究[48]提出DPSCs能夠促進角膜上皮細胞生長及角膜上皮再生，并具有阻止角膜結膜化，維持角膜透明的能力。Syedpicard等[49,50]報道DPSCs經體外誘導后具有分化為角膜基質細胞、角膜蛋白和硫酸角質素的能力，說明DPSCs具有分化為角膜基質細胞的潛能。這些研究證明，DPSCs在角膜再生組織工程研究中具有潛在的臨床應用價值，但是未來還需要進一步的研究探索DPSCs促進受損角膜再生的機制。

　　2.6、 其他

　　隨著組織工程學及交叉學科的融合發展，DPSCs在組織工程及再生醫學研究的應用領域也逐漸拓展。Han等[51]提出DPSCs能夠分化成肝細胞樣細胞并具有儲存糖原和生產尿素的功能，為肝病提供了有前景的治療方法。相關研究[52]提出DPSCs能分化為胰島素生成細胞，有望為糖尿病的治療開辟另一條嶄新的途徑。

　　3、 問題和展望

　　DPSCs多取材于自然替換的乳牙、第3磨牙、正畸牙或其他原因需要拔除的牙，是自體移植中容易獲取的種子細胞來源，具有作為組織工程種子細胞的諸多優勢，呈現出良好的臨床應用前景。盡管對DPSCs的研究應用已取得很多的突破，但是主要局限在動物模型上，要想將其成功用于臨床組織再生，還存在著諸多問題，如DPSCs的特異性表面標記物至今仍不明確；牙髓組織中難以確切定位；分化調控機制尚不清楚；體外培養周期長，難以大量擴增以及分化的哪個時期最適合移植等。

　　但是相信隨著組織工程技術的發展進步，生命科學、工程學及材料學等相關學科交叉發展，以及科研工作者的不懈努力，這些問題將會得到更加深入的探討和逐步解決。DPSCs的研究將日趨完善，并實現真正意義上的組織再生。

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